Peamine erinevus - geeni kloonimine vs PCR

Mitme DNA koopia sünteesi konkreetsest DNA fragmendist nimetatakse DNA amplifikatsiooniks. On kaks peamist DNA amplifitseerimise protsessi, nimelt geenide kloonimine ja PCR. Geenikloonimise ja PCR-i peamiseks erinevuseks on see, et geenkloneerimine tekitab in vivo spetsiifilise geeni mitu koopiat, konstrueerides rekombinantse DNA ja kasvades peremeesbakteris, samal ajal kui PCR toodab miljoneid koopiaid spetsiifilisest DNA fragmendist in vitro, läbides korduvaid tsükleid. denaturatsioon ja süntees.

Sisu 1. Ülevaade ja olulisemad erinevused 2. Mis on geenikloonimine 3. Mis on PCR 4. Võrdlus üksteisega - geenkloonimine vs PCR 5. Kokkuvõte

Mis on geenikloneerimine?

Geenide kloonimine on tehnika, mida kasutatakse konkreetse geeni leidmiseks ja paljundamiseks organismi ekstraheeritud genoomsest DNA-st rekombinantse DNA ehitamise teel. Genoomne DNA sisaldab tuhandeid erinevaid valke kodeerivaid geene. DNA ekstraheerimisel sisaldab see kõiki võimalikke geene, mida see kanda saab. Geenide kloonimistehnika on võimaldanud tuvastada spetsiifilise geeni kogu DNA-st. Seetõttu on geenide kloonimine oluline vahend molekulaarbioloogias.

Organismi genoomse raamatukogu moodustamine on geenide kloonimisel hädavajalik, kui vastava geeni asukohast DNA-s pole aimugi. Genoomikogu luuakse järgmiste sammude abil.

1. etapp: Kogu DNA ekstraheerimine organismilt, mis sisaldab soovitud geeni.

2. samm: ekstraheeritud DNA lagundamine restriktsioonil, et saada väikesi hallatavaid fragmente. Seda etappi hõlbustavad restriktsiooni endonukleaasid.

3. samm: sobiva vektori valimine ja vektori DNA avamine, kasutades samu restriktsiooni endonukleaase. Bakteriaalseid plasmiide ​​kasutatakse tavaliselt võõra DNA kandmiseks vektoritena. Plasmiidid on väikesed DNA ringid, mis asuvad bakterites.

4. samm: vektori DNA ja fragmenteeritud DNA kombineerimine rekombinantse DNA molekuli saamiseks. Seda etappi reguleerib DNA ligaas.

5. samm: rekombinantsete DNA molekulide ülekandmine peremeesbakteritesse. Seda etappi nimetatakse ümberkujundamiseks ja seda tehakse kuumašoki abil.

5. samm: transformeeritud bakterirakkude skriinimine söötmel. Transformatsiooni lõpus saadakse transformeeritud ja mittetransformeerunud peremeesrakkude segapopulatsioon. Kuna huvipakkuv geen hõlmab ainult transformeeritud peremeesrakke. Seega on vaja valida transformeeritud rakud. Valik tehakse selektiivsöötme abil, mis sisaldab antibiootikume. Ainult transformeeritud rakud kasvavad sellel skriinimissöötmel, mis võimaldab selektsiooni.

6. samm: Bakterite kasvatamine geenikogu loomiseks. Selles etapis viiakse transformeeritud peremeesrakud värskesse söötmesse, mis tagab optimaalse kasvunõude. Kultuuriplaatidel olevad kolooniad kokku tähistavad selle organismi genoomi raamatukogu.

7. samm: huvipakkuvat geeni sisaldav rekombinantne DNA molekul tuleb skriinida tuhandetest rekombinantse DNA kloonitud fragmentidest. Seda saab saavutada sondide abil, mis tähistavad spetsiifilist geeni või selle geeni tulemusel saadud spetsiifiline valk.

Kui bakteriaalset kolooniat sisaldav huvitatud geen on kogu kolooniate põhjal tuvastatud, on võimalik teha geeni sisaldava rekombinantse plasmiidi miljonid koopiad.

Geenide kloonimist kasutatakse geeniraamatukogude loomisel, spetsiaalsete valkude, vitamiinide, antibiootikumide, hormoonide tootmisel, organismide genoomide järjestamisel ja kaardistamisel, üksikute DNA koopiate tegemisel kriminalistikas jne.

Mis on PCR?

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on meetod, mis genereerib suure hulga konkreetse DNA fragmendi koopiaid. Spetsiifilise DNA järjestuse eksponentsiaalne amplifikatsioon saavutatakse PCR abil in vitro tingimustes. See tehnika on molekulaarbioloogias väga võimas tööriist, kuna selle abil saab väikese DNA proovi korrutada kasutatavaks koguseks. Kary Mullis tutvustas PCR-i 1983. aastal ja see auhinnatud leiutis lõi tohutu edasimineku molekulaarbioloogias.

PCR-meetod järgib korduvaid PCR-reaktsioone, nagu on näidatud joonisel 02. Üks PCR-reaktsioon koosneb kolmest põhietapist, mis toimuvad kolmel erineval temperatuuril; kaheahelalise denatureerimine DNA juures temperatuuril 94 ° C, praimerite lõõmutamine 68 ° C juures ja ahela pikenemine 72 ° C juures. Seetõttu tuleks PCR-i läbiviimisel temperatuuri kõikumist õige replikatsiooni jaoks kõrgel hoida. PCR viiakse läbi PCR-masinas PCR-torude sees. PCR-torud laaditakse õigete PCR-segudega, mis sisaldavad matriitsi DNA-d, Taq-polümeraasi, praimereid, dNTP-sid ja puhvrit. Kaheahelalise proovi DNA denatureerimine üheahelaliseks DNAks purustatakse vesiniksidemed komplementaarsete aluste vahel temperatuuril 94-98 ° C. Seejärel eksponeeritakse praimerite jaoks matriits-DNA üksikud ahelad. Tuleks varustada paar praimerit (edasi ja tagasi) ning need peaksid olema kõrge temperatuuri talumiseks termostabiilsed. Praimerid on üheahelalised lühikesed DNA järjestused, mis on komplementaarsed siht-DNA fragmendi otsadega. PCR-is kasutatakse sünteetilisi praimereid. Praimerid seostuvad proovi DNA komplementaarsete alustega ja algatavad uue ahela sünteesi. Seda etappi katalüüsib ensüüm nimega Taq polümeraas; termostabiilne DNA polümeraasi ensüüm, mis on eraldatud ettevõttest Thermus auqaticus. Kui praimerid ja nukleotiidid (ehitusplokid) on saadaval, konstrueerib Taq polümeraas uue DNA ahela, mis on komplementaarne matriitsi DNA-ga. PCR-programmi lõpus täheldatakse amplifitseeritud DNA fragmenti, kasutades geelelektroforeesi. Kui on vaja täiendavat analüüsi, puhastatakse PCR-produkt geelist.

PCR on väga kasulik geneetiliste ja omandatud haiguste diagnoosimiseks ja jälgimiseks, kurjategijate tuvastamiseks (kohtuekspertiisi valdkonnas), DNA sihtrühma struktuuri ja funktsioonide uurimiseks, organismide genoomide järjestamiseks ja kaardistamiseks jne. PCR on muutunud rutiinne laboritehnika meditsiini- ja molekulaarbioloogia uurimislaborites teadlaste seas, kuna sellel on lai valik rakendusi.

Mis vahe on geenkloonimisel ja PCR-il?

Geeni kloonimine vs PCR
Geeni kloonimine on protsess, kus rekombinantse DNA kaudu tehakse spetsiifilisest geenist mitu koopiat ja muundatakse peremeesbakteriks.PCR-meetodiga saadakse korduvate PCR-reaktsioonide tsüklite kaudu teatud DNA järjestuse koopiad in vitro.
Rekombinantse DNA konstrueerimise nõue
Geeni lokaliseerimiseks toodetakse rekombinantne DNA.Rekombinantset DNA-d ei toodeta.
Vajadus tööjõu järele
See protsess on töömahukas.Intensiivset tööjõudu pole vaja.
In vivo või in vitro protsess
Rekombinantse DNA konstrueerimine toimub in vitro ja DNA amplifikatsioon on in vivo.DNA amplifikatsioon toimub täielikult in vitro.

Kokkuvõte - geenkloonimine vs PCR

Geeni kloonimine ja PCR on kaks meetodit, mida kasutatakse DNA amplifitseerimiseks. PCR on in vitro protsess, mille käigus tehakse konkreetse DNA fragmendi DNA mitu koopiat ilma rekombinantset DNA ja peremeesorganismi kasutamata. Geeni kloonimine on peamiselt in vivo protsess, mille tulemusel saadakse rekombinantse DNA konstrueerimise teel peremeesorganismis huvitatud geenist mitu koopiat. See on erinevus geeni kloonimise ja PCR vahel.

Viide: 1. Griffiths, Anthony JF. "Konkreetse geeni kloonimine." Kaasaegne geneetiline analüüs. USA Riiklik Meditsiiniraamatukogu, 1. jaanuar 1999. Veeb. 22. veebruar 2017 2. ”Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR).” Riiklik biotehnoloogiaalane teabekeskus. USA Riiklik Meditsiiniraamatukogu, teine ​​veeb. 22. veebruar 2017

Pilt viisakalt: 1. “Joonis 17 01 06”: CNX OpenStax - (CC BY 4.0) Commonsi Wikimedia vahendusel